A legtöbb vírus genomi szekvenciája ismert.Nukleinsavpróbák, amelyek a DNS rövid szakaszai, amelyeket úgy terveztek, hogy hibridizálódjanak komplementer vírus DNS- vagy RNS-szegmensekkel.A polimeráz láncreakció (PCR) egy hatékonyabb módszer a vírusok kimutatására.A közelmúltban nagy teljesítményű diagnosztikai módszereket fejlesztettek ki.
A. Nukleinsav-hibridizációs technika
A nukleinsav-hibridizáció, amely elsősorban a Southern blottingot (Southern) és a Northern blottingot (Northern) foglalja magában, egy gyorsan fejlődő új technika a vírusdiagnosztikai területen.A hibridizációs vizsgálat indoklása az, hogy rövid DNS-szegmenseket (úgynevezett „próbát”) használnak, amelyeket úgy terveztek, hogy hibridizálódjanak komplementer vírus DNS- vagy RNS-szegmensekkel.Melegítéssel vagy lúgos kezeléssel a kettős szálú cél-DNS-t vagy RNS-t egyetlen szálra választják szét, majd szilárd hordozóra rögzítik.Ezt követően próbát adunk hozzá, és hibridizáljuk a cél DNS-sel vagy RNS-sel.Mivel a próba izotóppal vagy nem radioaktív nukliddal van megjelölve, a cél DNS vagy RNS autoradiográfiával vagy biotin-avidin rendszerrel detektálható.Mivel a vírusgenomok többségét klónozták és szekvenálták, kimutathatók vírusspecifikus szekvenciák segítségével, mint próbaként a mintában.Jelenleg a hibridizációs módszerek a következők: dot blot, in situ hibridizáció sejtekben, DNS-blot (DNS) (Southern-blot) és RNS-blot (RNS) (Northern-blot).
B.PCR technológia
Az elmúlt években egy sor in vitro nukleinsav-amplifikációs technikát fejlesztettek ki PCR-re alapozva érzéketlen vagy nem tenyészthető vírusok tesztelésére.A PCR egy olyan módszer, amely specifikus DNS-szekvenciát tud szintetizálni in vitro polimeráz reakcióval.A PCR folyamata három lépésből álló termikus ciklusból áll: denaturáció, annealing és extenzió Magas hőmérsékleten (93℃ ~ 95℃) a kettős szálú DNS két egyedi DNS-szálra válik szét;majd alacsony hőmérsékleten (37 ℃ ~ 60 ℃) két szintetizált nukleotid primer kapcsolódik a komplementer DNS szegmensekhez;míg a Taq enzim számára megfelelő hőmérsékleten (72 ℃) az új DNS láncok szintézise a primer 3' végétől kezdődik, komplementer DNS-t használva templátként és egyetlen nukleotidot anyagként.Tehát minden ciklus után egy DNS-lánc két láncra amplifikálható.Ezt a folyamatot megismételve, minden egy ciklusban szintetizált DNS-lánc templátként használható a következő ciklusban, és a DNS-láncok száma minden ciklusban megduplázódik, ami azt jelenti, hogy a PCR termelése 2n log sebességgel amplifikálódik.25-30 ciklus után a PCR termelődését elektroforézissel azonosítják, és a specifikus DNS-termékeket UV fényben (254 nm) lehet megfigyelni.Specificitása, érzékenysége és kényelme miatt a PCR-t számos vírusfertőzés, például HCV, HIV, CMV és HPV klinikai diagnosztikájában alkalmazták.Mivel a PCR nagyon érzékeny, képes kimutatni a vírus DNS-ét fg szinten, a műveletet nagyon óvatosan kell elvégezni, hogy elkerülje a hamis pozitív eredményt.Ezenkívül a nukleinsav teszt pozitív eredménye nem jelenti azt, hogy élő fertőző vírus van a mintában.
A PCR technika széleskörű alkalmazásával új technikákat és módszereket fejlesztenek ki a PCR technikán alapulva különböző vizsgálati célokra.Például a valós idejű kvantitatív PCR képes kimutatni a vírusterhelést;Az in situ PCR-t a szövetekben vagy sejtekben lévő vírusfertőzés azonosítására használják;A beágyazott PCR növelheti a PCR specificitását.Közülük gyorsabban fejlesztették ki a valós idejű kvantitatív PCR-t.Számos új technikát, például a TaqMan hidrolízis próbát, hibridizációs szondát és molekuláris beacon próbát kombináltak valós idejű kvantitatív PCR technikává, amelyet széles körben alkalmaznak a klinikai kutatásban.Ezzel a módszerrel a betegek testnedvében lévő vírusterhelés pontos azonosítása mellett gyógyszertűrő mutáns kimutatására is alkalmas.Ezért a valós idejű kvantitatív PCR-t elsősorban a gyógyító hatás értékelésében és a gyógyszertolerancia felügyeletében alkalmazzák.
C. Vírusos nukleinsavak nagy áteresztőképességű kimutatása
Az újonnan megjelenő fertőző betegségek gyors diagnosztizálására irányuló igények kielégítésére különféle nagy áteresztőképességű kimutatási módszereket, például DNS chipeket (DNS) hoztak létre.A DNS-chipek esetében specifikus próbákat szintetizálnak, és kis szilícium chipekhez kapcsolják nagyon nagy sűrűségben, hogy létrehozzák a DNS-próba microarray-t (DNS), amely hibridizálható a mintával.A hibridizáció jele konfokális mikroszkóppal vagy lézerszkennerrel leképezhető, és számítógéppel tovább feldolgozható, és hatalmas adatállomány nyerhető a különböző génekről.Kétféle DNS chip létezik.A „szintézis chip” a következő: a specifikus oligonukleotidokat közvetlenül a chipeken szintetizálják.Egy másik a DNS pool chip.A klónozott gének vagy PCR-termékek a tárgylemezre sorrendben vannak nyomtatva.A DNS chip technológia előnye a hatalmas mennyiségű DNS szekvencia egyidejű detektálása.A kórokozó-detektáló chip legújabb verziója több mint 1700 emberi vírus azonosítására képes egyszerre.A DNS-chip technológia megoldotta a hagyományos nukleinsav-hibridizációs módszerek problémáit, és igen széles körben alkalmazható a vírusdiagnosztikában és epidemiológiai vizsgálatokban.
Feladás időpontja: 2020-12-23